硒酵母對高效氯氰菊酯致小鼠肝損傷修復作用研究
李春霞1，陳凌云1，湯成華2，王廣儀3，黃 蓓1 ( 1． 安徽大學生命科學學院，合肥 230601; 2． 安徽省華信生物藥業股份有限公司，界首236500; 3． 安徽省化工研究院，合肥 230041)
摘要: 目的: 探討硒酵母對高效氯氰菊酯致小鼠肝損傷的影響，為科學補硒、合理服用有機硒產品拮抗農殘對人體的傷害奠定理論基礎。方法: 檢測小鼠體重、肝組織指數、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶及肝組織病理切片等指標的變化。結果: 研究表明，與對照組相比，喂食硒酵母的修復組其肝臟指數差異不明顯，小鼠血清中 ALT、 AST 活性分別降低了 65% 和 25% 。病理切片觀察發現，對 β － CYP 染毒小鼠喂食高劑量的硒酵母后，凋亡細胞減少 25% ，其肝臟高于 75% 的細胞核恢復到正常顏色。結論: 硒酵母對修復 β － CYP 誘導的肝損傷方面有顯著效果，其作用機理可能與抗氧化保護生物膜有關。
關鍵詞: 硒酵母; 高效氯氰菊酯; 肝損傷; 修復作用
中圖分類號: O627． 6 + 1 文獻標識碼: A 文章編號: 1005 － 5320( 2017) 05 － 0003 － 03
擬除蟲菊酯類農藥是繼有機磷、有機氯等農藥之后發展起來的一類新型殺蟲劑，已被廣泛應用。高效氯氰菊酯( beta – cypermethrin，β – CYP) 是目前國內最常用的一種擬除蟲菊酯類農藥，被我國列入替代高毒農藥的理想品種，產量占據了全世界殺蟲劑市場的 30% 。隨著 β － CYP 使用范圍的不斷擴大和使用量的增加，長期接觸低濃度 β － CYP引發的人類安全性問題已日益受到人們的關注。馬萍等［1］研究表明，較高劑量的高效氯氰菊酯可造成小鼠肝臟的氧化損傷。毛阿敏［2］以克氏原螯蝦為試驗材料，安麗等［3］ 以雄鼠為試驗材料，都發現 β － CYP 對機體免疫功能具有明顯的抑制作用。但目前有關修復 β － CYP 對生物體的損傷的研究報道還相對較少。
硒元素是在 1918 年由瑞典化學家 J． Jberzeliuz 發現的，并在 1973 年被世界衛生組織定為生物生命活動必需的微量元素，具有提高機體免疫力、抗癌、抗自由基、延緩衰老等作用。酵母是一種單細胞蛋白，是微量元素硒的良好載體。李愛芬等［4］研究顯示硒酵母對小鼠具有明顯的抗氧化功能。
本研究采用目前最常用的 4． 5% β － CYP 乳油對小鼠進行染毒，再喂食硒酵母，通過對小鼠肝臟指數、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶的測定及對肝組織病理切片的觀察，探討硒酵母對 β － CYP 誘導的小鼠肝損傷的影響。 1 材料與方法1． 1 材料、動物與試劑SPF 級昆明小鼠 30 只，體質量重( 20 ± 2) g，雄性，購自安徽醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號: SCXK ( 皖) 2011 － 002。硒酵母、酵母: 華信生物藥業股份有限公司; 4. 5% 高效氯氰 菊 酯: 安徽陸野農化有限責任公司; DL － 丙 氨 酸( 99. 0% ) 、DL － 門冬氨酸( 99. 0% ) : 華恒生物; α － 酮戊二酸( 99. 0% ) :上海博速醫藥科技有限公司; 2． 4 二硝基苯肼( 分析純) : 南京化學試劑股份有限公司; 丙酮酸( 98. 0% ) 阿拉丁; 磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉等試劑均為國產分析純。
1． 2 儀器與設備
酶標儀: 日本島津公司; Eppendorf centrifuge 5417Ｒ 離心機: 德國 Eppendorf 公司; EL204 電子天平: 上海特勒 － 托多利多儀器有限公司; 電熱恒溫水浴鍋: 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司; 旋渦混懸器: 美國安勝科技有限公司。
1． 3 方 法 1． 3． 1 動物分組與模型制備
取 SPF 級體重為 40 ± 2 g 的昆明種小鼠 30 只，隨機分成5 組，每組 6 只，即: 正常對照組，β － CP 染毒組，酵母組，硒酵母組，修復組。正常對照組采用蒸餾水，β － CYP 染毒組參考文獻［5 ～ 7］，確定染毒劑量水平 40 mg /kg，均經口灌胃給予酵母組( Yeast: 67. 5 mg /kg) 和硒酵母組( Se: 30 μg /kg， Yeast: 67. 5 mg /kg) ，修復組在給予 40 mg /kg 的 β － CYP 2 h 后，再給予硒酵母，連續灌胃 30 d，分別于實驗前稱小鼠體重，小鼠可以自由進食、進水。禁食不禁水 12 h 后，取血及臟器進行測定。
1． 3． 2 樣本制備
摘小鼠眼球取血，血樣 4℃ 靜置 2 h 后，3000 r/min，4℃離心 15 min，獲得上層血清，－ 20℃ 保存，用于 AST、ALT 的測定; 取血后快速取出肝臟，在冰冷的 PBS( pH = 7． 5) 中漂洗，濾紙拭干，稱重，計算肝臟指數; 將肝組織固定于 4% 多聚甲醛溶液，做石蠟切片觀察。
1． 3． 4 生化指標的測定和臟器指數的計算
谷丙轉氨酶( ALT) 的測定: 將底物緩沖液提前在 37℃水浴中預熱 5 min，取 0． 1 ml 血清于 EP 管中，加入 0. 5 ml 底物緩沖液，混勻后置 37℃水浴中保溫 30 min，加入 1 mmol /L 2． 4 二硝基苯肼溶液 0. 5 ml，混勻后置 37℃ 水浴中保溫 20 min，再加入 0. 4 mol /L 氫氧化鈉溶液 5 ml，用全波長酶標儀在 505 nm 波長下測吸光值，根據標準曲線求得 ALT 的活力單位( 以 U/L 表示) 。
谷草轉氨酶( AST) 的測定: 同 ALT 比色測定法，但酶反應作用時間改為 60 min。
臟器指數按公式如下計算:肝臟指數 =［肝臟重量( g) /體重( g) ］× 100%
1． 3． 4 數據統計分析
實驗數據以 x珋± s 表示，組間數據采用單因素方差分析，運用 SPSS 軟件進行統計分析，P ＜ 0. 05 表示差異顯著，P ＜ 0. 01 表示差異極顯著。
2 結果與分析
2． 1 硒酵母對 β － CYP 誘導的肝損傷小鼠肝臟指數的影響臟器指數是病理組織學觀察中衡量臟器損傷的病理學指標，尤其病理組織學檢查結果為將肝損傷一錘定音的最終診斷結果。我們分析比較了各組小鼠的肝臟指數，結果可知，與正常對照組比較，β － CYP 誘導的肝損傷小鼠的肝臟指數均顯著升高( P ＜ 0. 01) ，硒酵母組肝臟指數顯著升高( P＜ 0. 01) ，而酵母組、修復組差異不明顯。由上可知，β － CYP能夠造成肝損傷，硒酵母劑量相對于正常機體是超標的，但是在修復 β － CYP 誘導的肝損傷方面作用顯著。
2． 2 硒酵母對 β － CYP 誘導的肝損傷小鼠血清 AST、ALT的影響
ALT 與 AST 主要分布在肝臟的肝細胞內，肝細胞損傷時 ALT 和 AST 就會升高，其升高的程度與肝細胞受損的程度相一致。故本實驗選用 ALT 和 AST 作為探討硒酵母對 β － CYP 誘導的肝損傷保護作用的指標。
與對照組相比，β － CYP 染毒組小鼠血清中 ALT 和 AST活性分別增高了 80. 22% ( P ＜ 0． 01) 和 20. 71% ; 硒酵母組小鼠血清中 ALT 活性顯著增高了 38. 02% ( P ＜ 0. 05) ，而 AST活性升高不明顯; 而對小鼠 β － CYP 染毒后喂食硒酵母的修復組小鼠血清中 ALT 和 AST 活性分別明顯降低了 65. 20% 和 25. 49% 。
2． 3 硒酵母對 β － CYP 誘導的肝損傷小鼠肝組織病理學觀察
對不同處理組的石蠟切片及 HE 染色進行形態學觀察，如表 1 所示，與正常對照組相比，單獨喂食高劑量硒酵母組小鼠肝細胞生長周期減慢，核質比降低; 酵母組細胞分裂能力增強，細胞正常。給小鼠 β － CYP 染毒后，肝臟細胞核損傷比為 55. 9% 、凋亡小體出現率 32． 4% 及細胞質空泡化51. 6% ; 而對 β － CYP 染毒小鼠喂食高劑量的硒酵母后的修復組，其肝臟高于 75% 以上的細胞核恢復到正常顏色，不能恢復的細胞則通過包括細胞凋亡途徑死亡，凋亡小體出現率降至低于 25% 。
3、討論與結論
肝臟指數結果顯示，β － CYP 染毒造成了小鼠肝臟的損傷，使其代償性腫大，從這一側面說明 β － CYP 引起的肝損傷和免疫功能紊亂有關，原因可能是自由基引起的細胞病理性凋亡屬于免疫損傷范疇; 而灌胃硒酵母后肝臟指數有了明顯的降低，表明了硒酵母對 β － CYP 誘導的小鼠肝損傷有一定程度的保護作用。
本實驗中，染毒高效氯氰菊酯后，小鼠血清中的 ALT 和 AST 的活性升高，而喂食硒酵母后，小鼠血清中的 ALT 和 AST 活性明顯降低。且肝臟組織學觀察結果表明，小鼠 β － CYP 染毒后肝細胞出現了大量的空泡化及凋亡小體，而喂食硒酵母后細胞核損傷比與凋亡小體出現率均降低。另外，我們還發現使用的 30 μg /kg 高硒含量對小鼠肝損傷的恢復比較好，但對正常肝臟就有輕微的抑制其生長。有研究表明，高效氯氰菊酯是一種疏水性化合物，能聚集在細胞膜，改變膜的流動性，破壞膜的結構［6］。Grajeda － Cota P 等［8］ 也發現 β － CYP 進入機體后可以裂解為不穩定的氰腈，進而分解為氰化物和醛，而氰化物和醛也可產生氧自由基。故實驗中小鼠染毒 β － CYP 后，β － CYP 產生的氧自由基破壞了肝細胞的細胞膜、線粒體膜和核膜，肝細胞中的 ALT 和 AST 外 流，使得小鼠血清中的 ALT 和 AST 活性升高，線粒體基質中的物質外流，誘導凋亡因子( AIF) 、致死性蛋白及各種酶類釋放進入細胞質基質，破壞細胞結構，肝細胞出現空泡化和凋亡小體，細胞核中染色質降解，核染色變淺。研究顯示硒作為含硒的谷胱甘肽過氧化物酶( GSH － Px) 的活性中心，調節著生物體抗氧化防御體系的主要組成部分［9］。研究還發現，硒可抑制鼠脂質過氧化物產生和血清轉氨酶的活力，并可抑制脂質過氧化激發的肝細胞膠原形成。給小鼠喂食硒酵母后，提高了谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶活性，清除β － CYP 產生的氧自由基，保護了肝細胞的膜結構，對 β － CYP 誘導的小鼠肝損傷起到保護作用。
綜上所述，硒酵母對 β － CYP 誘導的小鼠肝損傷具有一定的預防保護作用，該作用機理可能與其抗氧化保護生物膜
有關。
參考文獻:
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